Spermatozoi – test di vitalità

Test di vitalità:

1. test all’eosina: si mescolano parti uguali di soluzione al 5% di  eosina Y e liquido seminale; gli spermatozoi danneggiati o morti si colorano in rosso mentre quelli vitali non si colorano.  
2. swelling test (HOS, test iposmotico): Questo metodo valuta la percentuale di spermatozoi con alterazioni funzionali della membrana cellulare correlate con il grado di integrità del DNA.  Si attua mescolando 0.1 ml di liquido seminale con 1 ml di soluzione di swelling (ipotonica rispetto al liquido seminale) ed incubando per almeno 30 minuti a 37° C (non più di 45 minuti). L’acqua, per osmosi, passa dalla soluzione ipotonica di Swelling all’interno degli spermatozoi ed in seguito a ciò gli spz. normali  si rigonfieranno   mentre quelli con funzione alterata della membrana non si rigonfieranno. Gli spz con rigonfiamento (spz normali)  vengono immersi in una soluzione isotonica che li riporterà a dimensioni normali e saranno utilizzati per la fecondazione in vitro. 
3. MAR test (“Mixed Anti-globuline Reaction”) o immunobead test –   permette di identificare l’eventuale presenza di un titolo significativo di anticorpi anti-spermatozoi (ASA) della classe IgG e IgA sulla superficie degli stessi spermatozoi.
   Gli ASA che si legano agli spz possono danneggiare la loro capacità fecondante a diversi livelli: ne inducono un effetto immobilizzante, promuovono la comparsa di agglutinazioni e interferiscono nell’interazione con gli ovociti, rendendo critica o impossibile la fecondazione. Quantità di anticorpi anti-spermatozoi >50% sono spesso associate a ridotto successo di fecondazione, mentre concentrazioni >90% escludono praticamente le possibilità di una gravidanza spontanea.
   Nell’uomo, gli ASA si producono per un difetto della barriera emato-testicolare da traumi, infezioni, infiammazioni, torsioni del testicolo, tumori maligni testicolari, ostruzioni epididimari, vasectomia.
4. GAT test (Gelatin Agglutination Test) – ricerca ASA nel plasma seminale  Quest’ultimo metodo si basa su una reazione di flocculazione in gelatina che usa spermatozoi mobili come antigene.
5. TUNEL test  (Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP Nick end Labeling) su liquido seminale per la ricerca di frammentazioni del DNA degli permatozoi: Il test di frammentazione del DNA spermatico o Tunel test, insieme al test  Sperm Chromatin Dispersion (SCD) è un ottimo metodo per valutare, in termini di percentuale, il grado di frammentazione del DNA dei singoli spermatozoi osservati a M.O. ad altissima risoluzione. Nonostante l’elevato grado di attendibilità, una delle principali limitazioni di questa tecnica è che, una volta processati, gli spermatozoi non possono essere utilizzati per la fecondazione in vitro.  Inoltre i risultati possono richiedere fino ad una settimana di tempo (7-18).
6. Valutazione della reazione acrosomiale indotta: a seguito dell’interazione fra l’acrosoma e la zona pellucida, si assiste alla reazione acrosomiale che inizia con l’ingresso di ioni calcio nel citoplasma e l’alcalinizzazione di quest’ultimo. Entrambi questi fenomeni possono essere artificialmente indotti mediante lo ionoforo del calcio A23187.  Nel rimodellamento citoplasmatico gli istoni sono sostituiti dalla protamina (6).
7. Sperm-mucus penetration test (Kremer test)
8. Test di penetrazione nella zona pellucida di ovociti umani: si mettono a contatto gli spz con la zona pellucida, tagliata mediante microdissettori, di ovociti non fertilizzabili conservati in soluzione salina concentrata per diversi mesi derivati da biopsie ovariche, cadaveri o FIV. Si contano gli spz legati alla zona pellucida. 
9. Test di penetrazione in oocita di hamster zona-free –  La fusione spermatozoo-oocita nel test di penetrazione in oocita di hamster è la stessa che avviene nell’uomo, poiché la fusione con la membrana vitellina dell’oocita inizia dalla membrana plasmatica che riveste il segmento equatoriale dello spermatozoo umano in cui è avvenuta la reazione acrosomiale. Il test differisce dalla situazione fisiologica, invece, per l’assenza della zona pellucida. Il test dell’oocita di hamster si basa sulla reazione acrosomiale, che avviene spontaneamente negli spermatozoi incubati in vitro per un periodo prolungato di tempo. Poiché questa procedura è meno efficiente di quanto non lo siano i processi biologici in vivo, e può coinvolgere anche meccanismi diversi, avviene spesso di ottenere risultati falsi negativi di pazienti i cui spermatozoi non riescono a superare il test dell’oocita di hamster ma riescono a fecondare gli oociti umani in vitro ed in vivo (World Health Organization, 1986).
10. Test all’arancio di acridina:  gli spz con DNA denaturato si coloreranno in verde.

[1] v.n.   >14%

[2] v.n.   >35%

[3] v.n.    >35%